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    PCR反應體系包括什么

     更新時(shí)間:2024-06-06 點(diǎn)擊量:289
      PCR是一種選擇性體外快速擴增DNA片段的方法。在體外以類(lèi)似于細胞內DNA的半保留復制過(guò)程,以擬擴增的模板DNA分子,與模板DNA互補的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應體系,經(jīng)過(guò)重復地變性一退火一延伸三步,擴增新的目的DNA鏈,這個(gè)過(guò)程通過(guò)控制反應體系的溫度來(lái)實(shí)現。那么你知道PCR反應體系包括什么嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!
     
      一、模板(template)
     
      模板即擴增用的DNA,可以是任何來(lái)源DNA(如基因組DNA、質(zhì)粒DNA等)或RNA(如總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等),但必須符合兩個(gè)條件:一是純度必須較高,二是濃度不能太高以免抑制。模板是待擴增的目的基因或特異片段,如診斷病人是否攜帶有突變基因時(shí),其模板就是提取的病人血液中的DNA或RNA片段。PCR對模板DNA的純度不要求很高,但應盡量不含有對PCR反應有抑制作用的雜質(zhì)存在,如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑、能與DNA結合的蛋白質(zhì)。
     
      二、引物(primers)
     
      人工合成的一對引物可以分別與兩條模板DNA互補結合的寡核苷酸序列,其中一條稱(chēng)為上游引物,另一條稱(chēng)為下游引物。引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物濃度一般為0.1~0.5umol/L,濃度過(guò)高會(huì )引起錯配和非特異擴增,濃度過(guò)低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過(guò)低。引物長(cháng)度一般為15~30bp,引物過(guò)長(cháng)或過(guò)短都會(huì )降低特異性。其3'末端一定要與模板DNA配對,末位堿基最好選用A、C、G(因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸)。引物GC占45%~55%,堿基應盡量隨機分布,避免嘧啶或嘌呤堆積,兩引物之間不應有互補鏈存在,不能與非目的擴增區有同源性。
     
      三、底物(dNTP)
     
      dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP溶液呈酸性,使用時(shí)應配成高濃度后,以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液將其pH調節至7.0~7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。一般存儲濃度為10mo/L,各成分以等當量配制,反應終濃度為20~200umol/L,如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(shí)(偏高或偏低),就會(huì )引起錯配。高濃度可加速反應,但同時(shí)增加錯誤摻入和實(shí)驗成本;低濃度可提高精確性,而反應速度會(huì )降低。
     
      四、PCR緩沖液(PCR buffer)
     
      緩沖液的成分最為復雜,除水外一般包括四種有效成分:①緩沖體系,一般使用HEPES或MOPS緩沖體系;②一價(jià)陽(yáng)離子,一般采用鉀離子,但在特殊情況下也可使用銨根離子;③二價(jià)陽(yáng)離子,即鎂離子,根據反應體系確定,除特殊情況外不需調整;④輔助成分,常見(jiàn)的有DMSO、甘油等,主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結構。
     
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